广西珍稀濒危药用石斛的繁育试验及内生菌根的初步研究
胡东南 郭顺星 候晓强
(1.广西药用植物园，南宁；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京)
摘要：本文利用生物学手段等，对广西的铁皮石斛进行了组织培养、内生真菌等试验研究，探索一种药用植物铁皮石斛根部微生物动态平衡方法，建立科学的真菌采收方法，对石斛资源进行保护和开发利用。
关键词：铁皮石解；茎段培养；快速繁殖；丛生芽诱导；内生菌根；纯培养
石斛是重要的名贵中药材，《神农本草经》、《本草纲目》等历代古籍各医书，对石斛的认识和应用有很多高见。《中华人民共和国药典》2005年版收载的药用石斛品种有金钗石斛 Dendrobium nobile Lindl.、铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.）、或马鞭石斛Dendrobium.fimbriatum Hook.var.oculatum Hook.及其近似的新鲜或干燥茎。
数十年来，不少学者对石斛的化学成分、药理作用及临床应用等进行了研究。利用石斛作为原料开发了脉络宁注射液、清咽宁、金嗓子喉宝等数十种中成药及保健品。石斛品种中的铁皮石斛（D. candidum ）是现阶段石斛属植物中经济价值最高的种类,其用途主要为药用及保健品使用,生产的主要产品有“铁皮枫斗”、铁皮枫斗晶(保健饮品)、铁皮枫斗胶囊、养阴益气胶囊等,铁皮石斛在药用上具有生津、止渴、镇痛、消除水肿等功效。
菌根 (mycorrhiza)是自然界中一种普遍的共生现象。它是土壤中菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体 (Frank,1885)。共生真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其它营养物质 ,而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等,从而达到互利互助 ,互通有无的高度统一。菌根大致可以分为外生菌根、内生菌根和内外生菌根三种，内生菌根又包括泡囊丛枝菌根、石楠类菌根和兰类菌根。石斛植物菌根属于内生菌根中的兰类菌根。
石斛对生长条件要求苛刻，自然繁殖力极低，生长缓慢，因而导致野生石解遭到掠夺性的采挖，数量急剧减少，已处于濒危状态，本研究采用广西的铁皮石斛作为研究对象进行繁育试验和内生菌根研究，探索一种药用植物药用植物铁皮石斛根部微生物动态平衡方法，建立科学的真菌采收方法，建立一种保护的措施和方法。
一、材料与方法
1、实验用原材料
本实验所用新鲜原材料采自广西环江九万山自然保护区、乐业雅长林场，经广西药用植物园和中国医学科学院药用植物所鉴定为药典所载的铁皮石斛（D. candidum ）。
2、组织快繁研究
2.1 试验方法
1 .2.1材料处理与接种
从生长健壮的植株上取直径约为0.7-1.OCm，长约4一6Cm的带侧芽的茎段，自来水冲洗2一3h，再用洗洁精浸泡1 min，洗净后用自来水冲30min。然后放于75%乙醇中浸305，再在0.1%升汞溶液中处理8一10min。表面消毒后，用无菌水冲洗5一6次，用滤纸吸干水分，切掉基部伤口褐化部分后，将茎段剪切成0.5一1 .OCm的小段(每段必须带节)，接种于培养基上，10d左右腋芽开始萌发，20d后芽长到1.SCm左右。此时，将芽切下转入下一步培养基。
1.2 .2培养基筛选
本实验采用了Ms培养基附加适量的激素进行筛选，实验表明:茎段芽诱导培养基以Ms+NAA0·1雌/L+6一BAI·0雌/L为最好，芽增殖与继代培养基以Ms+NAAO.1雌/L+6一BA3.0雌/L为最好;壮苗、生根培养基以1/2Ms+NAA 0.7雌/L为最好;以上培养基蔗糖均为3%，琼脂均为1%。以上各种培养基均用0.Zmol/L的HcL或K〔瓜来调节pH值为5.8一6.2。试管苗继代培养中，以40天换1次培养基，苗长势最好。培养基采用高压蒸汽灭菌，在0.1一0.15吻a压(120一125℃)下保持15一20 min。
1 .2.3培养器皿
初代培养采用50mL的锥形瓶，每瓶盛15mL培养基，用塑料膜封口，并用橡皮筋扎紧;继代、增殖和生根培养均用250mL的玻璃瓶，每瓶盛30-40mL培养基，用配套的塑料盖拧紧。
1 .2.4培养条件
培养温度为23士2℃，光周期12h/12h，光照强度1 500一2 ooolx。
3、铁皮石斛的菌根分离及培养试验
3.1 真菌的分离
2005年4月、5月将采自广西的铁皮石斛成株的根在流水下冲洗干净，切成 0 .5～ 1ｃｍ小段，用无菌水冲洗充分洗净，0.1%HgCl2表面消毒6～8ｍin，无菌水冲洗净消毒液后，再用 75%乙醇表面消毒 3～5ｓ，无菌水冲洗后将根段接于有PDA的培养皿内，25℃恒温培养，待从根部组织长出的真菌菌丝长入培养基时，截取菌丝顶端转移到另一有PDA的培养皿内，25℃恒温培养，并进行菌种纯培养。
3.2 真菌的鉴定
目前兰科菌根真菌的分类和鉴定还主要依靠形态学的方法，手动切片、Melzer氏液染色，光学显微镜下观察。
4、铁皮石斛无菌苗与菌根真菌的共生试验
将真菌纯培养得到纯种菌种，接种于组织培养得到无菌苗上，观察无菌苗在有菌后的生物特性。
二、结果与讨论
1、铁皮石斛的组织培养
本试验得到了3种组织无菌苗。
2、真菌的分离及培养
本试验经培养分离得到了34种根部内生真菌。
3、无菌苗与真菌的共生试验
略
4、讨论
试验结果表明，真菌与铁皮石斛形成菌根，真菌穿透根表层细胞，并在根被的某个细胞中定殖，然后由外皮层的通道细胞进入皮层薄壁细胞；皮层薄壁细胞层正是真菌与植物体相互作用的活跃部位，并为植株的生长提供必需的营养物质，从而使铁皮石斛的根际保持旺盛的生活力。郭顺星等[17]对我国云南、四川等地采集的野生铁皮石斛和金钗石斛根中的内生真菌进行分离并测定其生物活性。共分离获得内生真菌25种，主要属于担子菌和半知菌；生物活性测定结果表明其中5种真菌可促进铁皮石斛种子萌发；7种真菌可与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系，其中有3种真菌对幼苗有促生作用。
